SYTO 9/PI 活細菌/死細菌雙染試劑盒產品簡介：

（SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit）是一款方便且操作簡單的試劑盒，利用SYTO 9綠色核酸染料和碘化丙啶（PI）紅色熒光核酸染料來進行細菌活力的檢測，適用于大量的細菌種屬，包括蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產氣莢膜桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝桿菌、綠膿桿菌、Staphylococcus aureus、奧拉尼堡沙門氏菌、宋內志賀氏菌和化膿性鏈球菌。

SYTO 9/PI 活細菌/死細菌雙染試劑盒的工作原理在于：SYTO 9和PI的光譜特征以及穿透健康細菌細胞的能力不同。單獨使用時，SYTO 9能對群體內的所有細菌進行標記—具有完整膜和受損膜的細菌；相反，PI只能滲透進入受損的膜，PI的插入會引起SYTO 9染色熒光的降低，當體系內加入兩種染料時。因此，通過適量比例的SYTO 9和PI的混合染色，具有完整膜結構的細菌呈綠色熒光，而具受損膜結構的細菌呈紅色熒光。兩者染料的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別是480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本無熒光。本試劑盒兼容于熒光顯微鏡，熒光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀或其它熒光檢測儀器。

產品組成：

【注】組分C熒光顯微鏡檢測方法中才會應用的到，具體用法見注意事項3)。

試劑盒規(guī)格說明（按照建議的試劑稀釋倍數(shù)和單次測試體積來計算）：保存與運輸方法:-20℃避光保存，有效期一年。 冰袋運輸。

熒光顯微鏡檢測：1ml菌液加入3μl染料混合液（SYTO 1.5μl +PI 1.5μl），可做40次獨立測試。

熒光酶標儀檢測：2ml無菌水加入12μl染料混合液（SYTO 6.0μl +PI 6.0μl），制備成2×工作液。按照100μl染料混合液加入100μl菌液的比例使用，可做200次獨立測試。

流式細胞儀檢測：2ml菌液加入6μl染料混合液（SYTO 3.0μl +PI 3.0μl），可做20次獨立測試。

使用方法(以下步驟僅用作示例以指導科研人員開展自身細菌樣本的染色。)

一、培養(yǎng)條件和細菌懸液的制備：

【注意】：用本試劑盒進行細菌染色，務必要小心去除培養(yǎng)基殘留，因為，核酸和其它培養(yǎng)基成分可能以不可預料的方式與SYTO 9和PI結合，導致染色結果發(fā)生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養(yǎng)基內含的培養(yǎng)基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。

1.1 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)大腸桿菌或Staphylococcus aureus（30ml）使其生長至對數(shù)生長后期。

1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細菌培養(yǎng)物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當緩沖液來重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液的30-40ml離心管（設置為活細菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細菌）的30-40ml離心管（設置為死細菌組）。

1.5 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于10000×g離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。

1.10 對于大腸桿菌或Staphylococcus aureus的建議染色濃度，根據你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經、熒光酶標儀）或流式細胞儀來參考相應部分的染色條件。

二、染色條件的優(yōu)化：

試劑盒內的兩種染料都經過平衡優(yōu)化，按照1：1的比例進行混合用于絕大多數(shù)的樣本都能得到良好的區(qū)分活/死細菌。偶然情況下，兩種染料的混合比例需根據實際需求進行優(yōu)化調整。比如：在待檢樣本中，綠色熒光太突出，建議要么降低SYTO 9濃度，要么提高PI濃度。

為了全面優(yōu)化染色條件，建議測試梯度濃度的SYTO 9，每一種濃度與梯度濃度的PI進行組合染色。建議按照1ml細菌懸液加入3µl不同混合比率的染料預混液。

[注]：SYTO 9 +PI 對細菌的染色請按照說明書建議的15min來操作，不要超過30min。 SYTO 9有很好的細菌滲透性，我們給的實驗條件都是優(yōu)化過。 SYTO 9只有在哺乳動物細胞染色，可能會延長染色時間到120min。

由于染的是活菌+死菌的比例，請染色后盡快觀察，不要超過1h。 另，染色后基本是不用清洗的，除非覺得背景熒光很高，就是非細菌的菌體部分都能看到熒光，才有必要簡單清洗一次。

三、熒光顯微鏡操作步驟：

活菌和死菌的熒光可能用標準的熒光素長通濾片設置來同時觀察。替代方案的話，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用熒光素和Texas Red帶通濾光片設置。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設置見表1。

表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征：

3.1 在微量離心管內組合等量的組分A（SYTO 9）和組分B（PI），混勻。

3.2 每1ml細菌懸液內加入3μl染料預混液。按照建議的稀釋倍數(shù)，最終得到的染色工作液內含0.3% DMSO。更高濃度的DMSO可能對染色產生副效果。

3.3 混勻后室溫避光孵育15min。

3.4 吸5μl染色的細菌懸液到載玻片上，并蓋上18mm方形蓋玻片。

3.5 根據表1選擇熒光顯微鏡上合適的濾片來觀察。

四、熒光光度計操作步驟：

4.1 調整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個細菌/ml（~0.03 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為1×107個細菌/ml（~0.15 OD670）。用于熒光光度計檢測，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

4.2 參考表2在1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英熒光比色皿混勻五種不同比例的細菌懸液。每個樣本的總體積為3ml。

4.3 在微量離心管內分別加30μl組分A（SYTO 9）和30μl組分B（PI），混勻。

4.4 每組不同比例的細菌懸液內加入9μl染料預混液（5個樣本×9μl =45μl總量），用槍上下吹打數(shù)次使其混勻。

4.5 室溫避光孵育15min。

4.6 熒光測定和數(shù)據分析：

①用熒光光度計測定每組細菌懸液（Fcell）的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)：470nm，發(fā)射：490-700nm）

②分別測定發(fā)射光譜在510-540nm（em1，綠色）和620-650nm（em2，紅色）的累積熒光，并計算累積熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

③以大腸桿菌懸液內活細胞的占比為橫坐標，以累積綠色熒光與紅色熒光比（RatioG/R）為縱坐標，制圖

五、熒光酶標儀操作步驟：

針對細菌懸液，用熒光酶標儀的測定條件與熒光光度計的基本類似。如同熒光光度計的檢測步驟，染料濃度相同于熒光顯微鏡的建議濃度，綠/紅熒光比與活細菌相對數(shù)量呈正比。

5.1 調整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為2×108個細菌/ml（~0.06 OD670）或Staphylococcus aureus懸液（活和殺死）使其密度為2×107個細菌/ml（~0.3 OD670）。用于熒光酶標儀檢測，Staphylococcus aureus懸液的濃度通常比大腸桿菌少10倍。

5.2 參考表3在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內混勻五種不同比例的細菌懸液（大腸桿菌或Staphylococcus aureus）。每個樣本的總體積為2ml。

5.3 在微量離心管內分別加6μl組分A（SYTO 9）和6μl組分B（PI），混勻。

5.4 通過將所有的12μl上述預混液加入2ml無菌的dH2O，混勻后制備2×染色混合液。

5.5 吸100μl細菌懸液混合物到平底96孔板的各孔內，建議每個制備物做三個平行。96孔板的邊緣孔通常空置以避免假讀數(shù)。

5.6 更換新的槍頭，每孔加入100μl 2×染色混合液，上下吹打使充分混勻。

5.7 室溫避光孵育15min。

5.8 熒光測定和數(shù)據分析：

①以~485nm為激發(fā)波長，~530nm為發(fā)射波長（emission 1，綠色）來測定每孔熒光

②以~485nm為激發(fā)波長，~630nm為發(fā)射波長（emission 2，紅色）來測定每孔熒光

③通過測定兩種發(fā)射波長下的熒光強光，并計算熒光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2

④以大腸桿菌懸液內活細胞的占比為橫坐標，以RatioG/R為縱坐標，制圖

六、流式細胞儀操作步驟：

儀器的檢測配置可能要因實際情況來調整，但此處列出的檢測技術和設置參數(shù)適用于市場上絕大多數(shù)流式細胞儀。

6.1 調整大腸桿菌懸液（活和殺死）使其密度為1×108個細菌/ml（~0.03 OD670），之后用無菌dH2O稀釋100倍使其最終密度為1×106個細菌/ml。

6.2 參考表4在16×125mm高硼硅玻璃培養(yǎng)管內混11種不同比例的細菌懸液。每個樣本的總體積為2ml。

注意事項：

1由于試劑盒內SYTO 9和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后，務必低速離心沉至管底后再開蓋。

2兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中，所以后續(xù)無需再單獨添加，第一次使用可將SYTO 9和PI根據單次用量分裝保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3組分C（Mounting oil）主要應用于熒光顯微鏡檢測法，菌液加到載玻片后，接著滴1-2滴組分C用于將細菌固定在膜上,25℃的折射率是517 ± 0.003。不要用作浸油（Immersion oil）。

4SYTO 9和PI結合核酸，PI是潛在的誘變劑，目前沒有數(shù)據闡明SYTO 9的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當防護。DMSO能促進有機分子進入組織。強烈建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料，含此類染料的試劑經活性炭吸附后再進行廢液處理。活性炭之后經焚燒來破壞染料。

5為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。